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上海郑核生物科技有限公司 
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| 荧光定量PCR实验报告及结果展示-上海郑核 |
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- 发布时间：2021年10月14日
- 有 效 期：2022年04月15日
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一、实验器材及试剂
二、荧光定量PCR实验步骤
1、总RNA抽提（枪头和离心管均经过湿热灭菌，无RNA酶）
1）取匀浆管，加入1ml的RNA提取液，置冰上预冷。
2）取100mg组织，加入到匀浆管中。
3）匀浆仪充分研磨直至无可见组织块。
4）12000rpm离心10min取上清。
5）加入250 μl三氯甲烷，颠倒离心管15s，充分混匀，静置3min。
6）4℃ 下12000rpm离心10min。
7）将400 μl上清转移到一新的离心管中，加入0.8倍体积的异丙醇，颠倒混匀。
8）-20℃ 放置15min。
9）4℃下12000rpm离心10min，管底的白色沉淀即为RNA。
10）吸除液体，加入75%乙醇1.5ml洗涤沉淀。
11）4℃下12000rpm离心5min。
12）将液体吸除干净，将离心管置于超净台上吹3min。
13）加入15μl无RNA酶的水溶解RNA。
14）55℃ 孵育5min。
15)使用Nanodrop 2000检测RNA浓度及纯度：仪器空白调零后取2.5μl 待测RNA溶液于检测基座上，放下样品臂，使用电脑上的软件开始吸光值检测。
16）将浓度过高的RNA进行适当比例的稀释，使其终浓度为100-500 ng/μl。
2、反转录（枪头和PCR均经过湿热灭菌，无RNA酶）
1）逆转录反应体系配制（推荐20 μL反应体系）
Component Volume
5 x Reaction Buffer 4 μL
Oligo (dT)18?Primer (100 μM) 0.5 μL
And Random Hexamer primer (100 μM) 0.5 μL
Servicebio?RT Enzyme Mix 1 μL
Total RNA/mRNA* 10 μL
RNase free water Add to 20 μL
2）轻轻混匀并离心
3）逆转录程序设置*
Temperature Time
25℃ 5 min
42℃ 30 min
85℃ 5 sec
3、定量PCR
1）取0.2ml PCR管，配制如下反应体系，每个反转录产物配制3管。
2× qPCR Mix 7.5μl
2.5μM基因引物 1.5μl
反转录产物 2.0μl
ddH2O 4.0μl
2）PCR扩增
预变性 95℃，10min
循环（40次） 95℃，15s→60℃，30s
熔解曲线 65℃→95℃，每15s升温0.3℃
4、结果处理
ΔΔCT法：
A=CT(目的基因，待测样本)- CT(内标基因，待测样本)
B=CT(目的基因，对照样本)- CT(内标基因，对照样本)
K=A-B
表达倍数=2- |
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